Lavado de material y manejo de medios de cultivo
Introducción
La citogenética se encarga del estudio de los cromosomas y sus anomalías (Universidad de Buenos Aires, 2012), por lo que muchas veces se utilizan cultivos celulares con el fin de obtener dicho material de estudio. Los cultivos celulares son el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células 'in vitro', manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas Universidad del País Vasco, 2015).
Al trabajar con cultivos celulares, es importante prevenir cualquier tipo de contaminación microbiana, sobre todo porque las células eucariotas crecen de forma muy lenta a comparación de formas de vida como las levaduras y las bacterias (Cultek, 2007).
Por lo anterior, resulta esencial mantener el área de trabajo en condiciones libres de microorganismos contaminantes al elaborar cultivos celulares. La máxima asepsia requerida se logra gracias a diversas técnicas de esterilización y desinfección, para mantener tanto el ambiente como los materiales estériles (Cultek, 2007).
Recordemos que la esterilización se refiere al conjunto de operaciones destinadas a eliminar o matar los microorganismos patógenos y no patógenos, incluidas las esporas, mientras que la desinfección es el proceso que elimina la mayoría o todos los microorganismos sobre los objetos inanimados con la excepción de esporas bacterianas.
Existen diversos métodos de esterilización, que pueden ser físicos, químicos o mecánicos. Algunos ejemplos se mencionan a continuación.
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Físicos:
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Calor Húmedo: La destrucción de los microorganismos es gradual, lo que termina por causar el efecto es la desnaturalización y coagulación de las proteínas de estos.
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Calor Seco: La temperatura utilizada también provoca desnaturalización de proteínas, además de la oxidación de componentes celulares.
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Rayos UV: Se forman dímeros de pirimidina en el DNA de los microorganismos, inhibiendo así la síntesis de DNA.
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Químicos:
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Gases: Son agentes químicos, y algunos, como el óxido de etileno, son agentes alquilantes del DNA, produciendo mutaciones.
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Mecánicos:
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Filtración: Sirve para esterilizar líquidos y gases, estos pasan por una membrana porosa, que impide el paso de microorganismos dependiendo del tamaño del poro.
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Existen diversos tipos de esterilización debido a que no todos los materiales se pueden esterilizar de la misma manera. Por ejemplo, es común la esterilización en calor húmedo utilizando el autoclave, pero este método no se recomienda cuando existen materiales que se puedan oxidar. En general, la esterilización por calor no se recomienda si existen sustancias termolábiles.
Durante esta actividad se simuló la preparación de un cultivo celular, sin uso de material biológico, verificando así la efectividad de diversas técnicas de esterilización y desinfección.
La desinfección del área de trabajo se llevó a cabo en dos pasos: primero, usando agua y jabón, y luego con cloruro de benzalconio (comercialmente conocido como benzal). El jabón sirve como agente desinfectante porque estos son detergentes aniónicos; mientras que el cloruro de benzalconio es un desinfectante de bajo nivel, catiónico, que actúa en la membrana celular, provocando la salida de los compuestos fosforilados, permitiendo la entrada del desinfectante y así, la desnaturalización de las proteínas de la célula. Tanto el jabón como el cloruro de benzalconio afectan principalmente a bacterias Gram (+) (Vignoli, 2002).
Además, se llevó a cabo la esterilización del material a usar por calor húmedo, es decir, en autoclave. Estos aparatos son sistemas cerrados herméticamente que permiten la formación de calor a alta presión (1 atm) y temperatura (121 °C), lo que desnaturaliza las proteínas de microorganismos (incluyendo formas esporuladas) que puedan estar presentes, destruyendolos (Serra, 2013).
El material autoclavado durante la sesión incluyó los matraces Erlenmeyer (de vidrio), los tapones de estos (de hule) y pinzas. Una ventaja que ofrece el autoclave es que permite la esterilización de una amplia variedad de material, ya que solo no se recomienda su uso para materiales sensibles a la humedad, como papel, metal que no sea inoxidable y soluciones que forman emulsiones con el agua (Universidad de Buenos Aires, s.f.)(Fpsanidad, s.f.).
Este método de esterilización también sirvió para la preparación de la simulación de cultivo celular. Tras haberlo preparado, se dejó incubar durante una semana, tras la cual se observaba completamente traslúcida, sin más coloración que la dada por los medios líquidos. La turbidez de una solución es una manera de determinar si existe contaminación bacteriana o por levaduras (Otero, 2014), aunque existen otras formas de verificar esto, como pruebas de espectrofotometría, observación de un frotis del cultivo bajo el microscopio, o tinción de Gram con muestras del material.
Fundamentos
Materiales
Metodología
Resultados
El frasco con el medio de cultivo celular no presentó contaminación bacteriana o fúngica tras una semana de incubación, lo que se puede determinar por la apariencia traslúcida del contenido (presentaba un ligero amarillo producto de los medios líquidos).
Referencias
Cultek (2007) “Cultivos Celulares” Consultado el 26 de febrero de 2017 de http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Cultivos%20Celulares/Aplica_Cultivos_Celulares_2007.pdf
Fpsanidad (s.f.) “Esterilización” Consultado el 26 de febrero de 2017 de http://www.fpsanidad.es/apuntes/hmhlm/esterilizacion.pdf
Serra, M. (2013) “Guía para el manejo del autoclave en la Central de Esterilización del Hospital Universitario de Cueta” España: Instituto Nacional de Gestión Sanitaria.
Universidad de Buenos Aires (s.f.) “Esterilización > Generalidades” Consultado el 26 de febrero de 2017 de http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/Seminarioesterilizacion.htm
Universidad de Buenos Aires (2012) “El Estudio de los Cromosomas Humanos” Consultado el 26 de febrero de 2017 de http://www.fmed.uba.ar/depto/histo1a/genetica/adm/sg2.pdf
Vignoli, R. (2002) “Esterilización y desinfección” Consultado el 26 de febrero de 2017 de http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2027.pdf
Utilidad
La preparación de un buen cultivo celular es esencial para poder obtener preparaciones cromosómicas de calidad para su análisis citogenético. El primer paso para lograr esto es desde luego el mantener condiciones de esterilidad adecuadas, tanto durante el procedimiento de preparación del cultivo como en el cultivo en sí.